Méthodes de transfert des gènes :
Les vecteurs de transfert sont considérés comme le facteur limitant principal de la thérapie génique.
Un vecteur, un retrovirus rendu inoffensif, est utilisé pour introduire le gène sain dans le noyau de la cellule et ainsi de remplacer le gène déficient. Ce vecteur permet d’introduire le matériel génétique dans la cellule cible par « transfert ».
L’avantage du retro-virus c’est qu’il est capable de s’intégrer au génome de la cellule, à la différence de l’adénovirus. En se divisant, la cellule, modifiée par ce retrovirus, transmet également le gène médicament à ses cellules filles. Or les cellules de la möelle osseuse ont la particularité de se diviser énormément, au minimum de dix à onze fois.
 La séquence ADN avant le traitement du gène infecté |
 Réinsertion du gène traité dans la séquence ADN (voir méthode du gène-suicide). |
Les principaux points à considérer sont :
- le ciblage de la population cellulaire
- l’efficacité du transfert (souvent faible, de l’ordre de 10 à 15% des cellules)
- l’intensité et la durée d’expression de la séquence intégrée.
Dans les premiers essais chez l’homme, on a transféré des gènes marqueurs : le gène de résistance à la néomycine ou le gène codant pour la galactosidase. Cela a permis d’obtenir des données importantes sur la toxicité potentielle du transfert des gènes.
Transfert par vecteurs viraux recombinants :
Les différents modes de transfert sont :
- utilisation directe de vecteurs viraux
- injection de cellules produisant le vecteur viral pour éviter son inactivation trop rapide par le complément.
Ces cellules sont appelés cellules transcomplémentantes (ou cellules d’encapsidation), elles produisent des virus non pathogènes par suppression des gènes nécessaires à leur réplication , à la place on insère la séquence voulue et des éléments régulateurs.
Les vecteurs viraux classiques :
Résumé des caractéristiques des principaux vecteurs sous forme de tableau :
| Famille de virus | Rétrovirus | Adénovirus | HSV | Parvovirus | Adenovirus associated virus |
| Type de Virus | ARN | ADN | ADN | ADN | ADN |
| Infection des cellules ne se divisant pas | Non | Oui | Oui | Oui | Oui |
| Production à haut titre | + | ++++ | +++ | ++ | + |
| Intégration dans le génome de la cellule | Oui | Non | Non | Non | Oui |
| Longueur des séquences incérées | 8kb | 8kb | 30kb | 5kb | |
| Stabilité | ++ | + | ++ | ++ | ++ |
| Caractéristique | Utilisation préférentielle ex vivo. Risque de modification des propriétés cellulaires lors du traitement mitogène. |
Non pathogène. Tropisme pour les cellules tumorales. Activité oncolytique. |
Non pathogène. Réplication dépendante d’un virus assistant. Activité oncolytique. |
||
| Limites de leur emploi | Insertion aléatoire du gène avec risque d’activation des gènes.
|
Stabilité moyenne ( car extra-chromosomique). Imunogènicité potentielle. Risque de recombinaison avec un virus sauvage. |
Effet cytopathique. Difficulté de régulation de l’expression du gène thérapeutique. |
Caractéristique :
- utilisation préférentielle ex vivo
- risque de modification des propriétés cellulaires lors du traitement mitogène
- non pathogène
- tropisme pour les cellules tumorales
- activité oncolytique
- non pathogène
- réplication dépendante d’un virus assistant
- activité oncolytique
Limites de leur emploi :
- insertion aléatoire du gène avec risque d’activation des gènes
- stabilité moyenne ( car extra-chromosomique)
- imunogènicité potentielle
- risque de recombinaison avec un virus sauvage
- effet cytopathique
- difficulté de régulation de l’expression du gène thérapeutique
Les vecteurs viraux à l’étude :
Les poxvirus (canarypox virus) :
Ils ont une forte capacité d’infection des cellules avec ou sans division, il n’y a pas d’intégration dans l’ADN.
L’importance de leur génome permet de larges insertions génétiques
Ils présentent une faible toxicité pour le patient et l’environnement.
Les lentivirus :
Dérivés d’une autre famille rétro virale, ils sont capables de transduire des cellules qui ne se divisent pas.
La possibilité d’obtenir la formation accidentelle de particules infectieuses (VIH) est maintenant exclue.
Transfert par plasmides :
Les plasmides sont des molécules d’ADN double brin circulaires surenroulées contenant généralement :
- une origine de réplication bactérienne, qui permet la production des plasmides dans les souches bactériennes.
- un gène dont l’expression la résistance à un antibiotique permettant la sélection des bactéries contenant le plasmide.
- la cassette d’expression , contenant le transgène thérapeutique , un promoteur et une séquence de terminaison d’expression.
Ils offrent certains avantages par rapport aux virus : facilité de manipulation, capacité d’insertion de séquences importantes, faible immunogénicité.
Méthodes classiques de transfection :
- complexation avec des vecteurs synthétiques.
Les vecteurs synthétiques ont pour fonction principale de compacter l’ADN, de favoriser son passage à travers la membrane plasmique et sa pénétration nucléaire.
On en utilise plusieurs types :
- les lipides cationiques qu’on associe à l’ADN sous forme de micelles ou de liposomes.
- les polymères polycationiques qui forment avec l’ADN des particules appelées polyplexes.
- co-précipitation avec du phosphate de calcium.
Améliorations :
- formation de complexes transferrine-ADN-polylysine : internalisation après fixation au récepteur de la transferrine .
- incorporation d’anticorps anti-marqueurs cellulaires aux complexes ADN-liposomes.
- emploi d’adjuvents pour améliorer les performances des vecteurs.
L’électrotransfert :
On parle également d’électroporation ou d’électroperméabilisation.
Cette technique consiste à soumettre les cellules à des impulsions électriques pour y faire pénétrer des séquences d’ADN.
Cette perméabilisation est transitoire et réversible .
La transgénèse :
Elle consiste à administrer à un stade précoce de l’embryogénèse une construction virale capable de s ‘exprimer dans toutes les cellules de l’embryon.
La transgénèse humaine conduirait à une modification stable de l’espèce et a été unanimement condamnée.
