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il y a 17 heures … Des scientifiques britanniques et américains sont parvenus à guérir des patients.. .www.maxisciences.com/hémophilie/de-la-therapie-genique-pour-guerir-les- hemophiles_art19550.html (lire la suite)

Il existe différentes voies d’approche dont le seul point en commun est d’utiliser le transfert des gènes.

La cancérologie est un exemple intéressant car toutes les approches sont utilisées contre cette pathologie.

Méthode du gène suicide :

Transfert de gènes rendant les cellules cibles sensibles à une drogue.

L’objectif est l’activation spécifique d’une pro-drogue non toxique en drogue cytotoxique uniquement au sein des cellules tumorales.

Le principe est de transférer in vivo, dans les cellules tumorales un gène codant pour une enzyme normalement absente du patrimoine des cellules.

Cette enzyme a la capacité de transformer la prodrogue non toxique en un métabolite toxique.

Le système le plus expérimenté est celui de la thymidine kinase du virus de l’herpés (HSV) de type 1 qui agit sur le ganciclovir comme prodrogue.

Seul le ganciclovir triphosphate est actif, la première phosphorylation se faisant par la TK (thymidine kinase) virale. Le GCV-TP est un analogue nucléosidique de la guanosine qui s’incorpore aux chaines d’ADN en élongation et induit l’apoptose.

Des essais de phase III sont en cours dans le traitement du glioblastome.

D’autres enzymes sont employés dans ce type de stratégie :

• la cytosine désaminase transforme la 5FC en 5FU.
• la XGPRT permet le passage de la 5-thioxanrthine en un métabolite toxique.
• le cytochrome P450-2B1 transforme le cyclophosphamide en 4-Ohcyclophosphamide.

On observe actuellement la mort d’une quantité beaucoup plus importante de cellules que le nombre initial de cellules transfectées.

Cet effet de voisinage ou « effet bystander » implique probablement :

• le transfert intercellulaire de métabolites phosphorylés du GCV par les « gap junction « .
• la transmission d’un signal apoptique.
• des mécanismes immunologiques : accroissement de l’expression de cytokines et infiltration par des CPA et des LT des tumeurs et de leurs métastase.

L’effet « bystander » est cependant limité : on estime qu’une cellule transduite permet au maximum la mort de six à sept cellules avoisinantes.

Codage des gènes

Les vecteurs de transfert sont considérés comme le facteur limitant principal de la thérapie génique.

Un vecteur, un retrovirus rendu inoffensif, est utilisé pour introduire le gène sain dans le noyau de la cellule et ainsi de remplacer le gène déficient. Ce vecteur permet d’introduire le matériel génétique dans la cellule cible par « transfert ».

L’avantage du retro-virus c’est qu’il est capable de s’intégrer au génome de la cellule, à la différence de l’adénovirus. En se divisant, la cellule, modifiée par ce retrovirus, transmet également le gène médicament à ses cellules filles. Or les cellules de la möelle osseuse ont la particularité de se diviser énormément, au minimum de dix à onze fois.

La séquence ADN avant le traitement du gène infecté

Réinsertion du gène traité dans la séquence ADN (voir méthode du gène-suicide).

Les principaux points à considérer sont :

• le ciblage de la population cellulaire
• l’efficacité du transfert (souvent faible, de l’ordre de 10 à 15% des cellules)
• l’intensité et la durée d’expression de la séquence intégrée.

Dans les premiers essais chez l’homme, on a transféré des gènes marqueurs : le gène de résistance à la néomycine ou le gène codant pour la galactosidase. Cela a permis d’obtenir des données importantes sur la toxicité potentielle du transfert des gènes.

Transfert par vecteurs viraux recombinants :

Les différents modes de transfert sont :

• utilisation directe de vecteurs viraux
• injection de cellules produisant le vecteur viral pour éviter son inactivation trop rapide par le complément.

Ces cellules sont appelés cellules transcomplémentantes (ou cellules d’encapsidation), elles produisent des virus non pathogènes par suppression des gènes nécessaires à leur réplication , à la place on insère la séquence voulue et des éléments régulateurs.

Les vecteurs viraux classiques :

Résumé des caractéristiques des principaux vecteurs sous forme de tableau :

Caractéristique :

• utilisation préférentielle ex vivo
• risque de modification des propriétés cellulaires lors du traitement mitogène
• non pathogène
• tropisme pour les cellules tumorales
• activité oncolytique
• non pathogène
• réplication dépendante d’un virus assistant
• activité oncolytique

Limites de leur emploi :

• insertion aléatoire du gène avec risque d’activation des gènes
• stabilité moyenne ( car extra-chromosomique)
• imunogènicité potentielle
• risque de recombinaison avec un virus sauvage
• effet cytopathique
• difficulté de régulation de l’expression du gène thérapeutique

Les vecteurs viraux à l’étude :

Les poxvirus (canarypox virus) :

Ils ont une forte capacité d’infection des cellules avec ou sans division, il n’y a pas d’intégration dans l’ADN.

L’importance de leur génome permet de larges insertions génétiques

Ils présentent une faible toxicité pour le patient et l’environnement.

Les lentivirus :

Dérivés d’une autre famille rétro virale, ils sont capables de transduire des cellules qui ne se divisent pas.

La possibilité d’obtenir la formation accidentelle de particules infectieuses (VIH) est maintenant exclue.

Transfert par plasmides :

Les plasmides sont des molécules d’ADN double brin circulaires surenroulées contenant généralement :

• une origine de réplication bactérienne, qui permet la production des plasmides dans les souches bactériennes.
• un gène dont l’expression la résistance à un antibiotique permettant la sélection des bactéries contenant le plasmide.
• la cassette d’expression , contenant le transgène thérapeutique , un promoteur et une séquence de terminaison d’expression.

Ils offrent certains avantages par rapport aux virus : facilité de manipulation, capacité d’insertion de séquences importantes, faible immunogénicité.

Méthodes classiques de transfection :

• complexation avec des vecteurs synthétiques.

Les vecteurs synthétiques ont pour fonction principale de compacter l’ADN, de favoriser son passage à travers la membrane plasmique et sa pénétration nucléaire.

On en utilise plusieurs types :

• les lipides cationiques qu’on associe à l’ADN sous forme de micelles ou de liposomes.
• les polymères polycationiques qui forment avec l’ADN des particules appelées polyplexes.
• co-précipitation avec du phosphate de calcium.

Améliorations :

• formation de complexes transferrine-ADN-polylysine : internalisation après fixation au récepteur de la transferrine .
• incorporation d’anticorps anti-marqueurs cellulaires aux complexes ADN-liposomes.
• emploi d’adjuvents pour améliorer les performances des vecteurs.

L’électrotransfert :

On parle également d’électroporation ou d’électroperméabilisation.

Cette technique consiste à soumettre les cellules à des impulsions électriques pour y faire pénétrer des séquences d’ADN.

Cette perméabilisation est transitoire et réversible .

La transgénèse :

Elle consiste à administrer à un stade précoce de l’embryogénèse une construction virale capable de s ‘exprimer dans toutes les cellules de l’embryon.

La transgénèse humaine conduirait à une modification stable de l’espèce et a été unanimement condamnée.

La thérapie génique est une nouvelle méthode thérapeutique dont l’objectif est l’introduction d’une séquence d’informations génétiques dans un type de cellules afin de traiter le gène atteint.

Ex : Le gène responsable du DICS-X est identifié et séquencé : le but de la thérapie génique est de le remplacer par un gène sain. Ainsi la Thérapie génique consiste à remplacer un gène défectueux par sa copie normale (saine).

1 – La séquence d’informations géniques :

Séquençage

2 – Le type de cellules :

L’ADN ou ARN codant pour la protéine dont on cherche l’expression.

Codage des gènes

3 – Le vecteur :

Un vecteur, un retrovirus rendu inoffensif, est utilisé pour introduire le gène sain dans le noyau de la cellule et ainsi de remplacer le gène déficient. Ce vecteur permet d’introduire le matériel génétique dans la cellule cible par « transfert ».

L’avantage du retro-virus c’est qu’il est capable de s’intégrer au génome de la cellule, à la différence de l’adénovirus. En se divisant, la cellule, modifiée par ce retrovirus, transmet également le gène médicament à ses cellules filles. Or les cellules de la möelle osseuse ont la particularité de se diviser énormément, au minimum de dix à onze fois.

Le gène à traiter, ou gène infecté, est désolidarisé du séquençage ADN (ici partie violette en bout de gène)

Zoom traitement

Zoom gène sain

Zoom gène sain

Le gène traité par « transfert de gènes » est ensuite réinséré dans la séquence, et par voie de conséquence, réintroduit dans le corps humain (voir : Thérapie Génique / Le Principe).

Du point de vue éthique, la convention de bioéthique du conseil de l’Europe a statué que cette thérapie s’appliquait uniquement aux cellules somatiques et non germinales afin d’éviter la transmission héréditaire de l’expression du nouveau gène.

Dans un premier temps les maladies génétiques monogéniques sont apparues comme la cible idéale étant donné qu’un seul gène était impliqué et identifié.

Mais rapidement les essais ont été recentrés sur les maladies acquises comme le cancer ou le sida. Il est en effet à priori plus aisé de détruire que de réparer une cellule :

Chacune de ces méthodes ne requiert qu’une expression transitoire du transgène.

Actuellement 396 essais cliniques ont été réalisés sur 3300 patients.

Ils concernent :

• le cancer à 64 %
• les maladies infectieuses à 8%
• les maladies héréditaires monogéniques à 15 %
• le marquage cellulaire à 10 %
• autres 3%

Les premiers résultats sont globalement encourageants même s’il a fallut attendre plus de 10 ans après le premier essai.

Deux succès sont à noter au cours de l’année 2000 :

• la guérison par l’équipe du professeur Fischer de trois nourrissons atteints d’immunodéficience congénitale profonde à Necker –Enfants malades Paris.
• la réduction d’une tumeur cérébrale d’un patient de la Pitié-Salpêtrière par l’équipe du professeur Klatzmann.

Il est à noter en revanche le premier décès d’un jeune américain au mois de mai des suites d’une charge de vecteurs viraux trop intensive. Ce « semi-échec » (taux de réussite : 2 sur 3 si l’on compare l’expérience américaine avec la française) a donné naissance à une vive polémique mondiale dans les milieux concernés.

La thérapie génique est une nouvelle méthode thérapeutique dont l’objectif est l’introduction d’une séquence d’informations génétiques dans un type de cellules afin de traiter le gène atteint.

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